试验研究应用超声波破碎苏云金芽孢杆菌试验魏万勇1苏智先2（1.四川省蚕丝学校，四川南充637000 2.西华师范大学，四川南充637000）结果表明：在试验条件下，超声波破碎达到95%以上的破碎率所需时间为30~ 50min，尤其是菌液浓度为每毫升50亿，用510变幅杆破碎，40min破碎率可达99.9%.而细菌的芽孢，无论是采用幅杆*6或510，其破碎效果不明显。

　　Bt）是农业上研究最多，应用最广的一类微生物，随着生物技术的发展，对苏云金芽孢杆菌的研究越来越深入。在一些研究中，需要有效地破碎苏云金芽孢杆菌细胞。目前，应用于细胞破碎的方法有物理和化学的两类，在物理破碎方法中主要有玻璃匀浆器破碎、高压细胞破碎、液氮破碎、高速组织捣碎机破碎、超声波破碎等，本试验应用了常用的超声波破碎法，分别对苏云金芽孢杆菌的营养细胞和芽孢进行了破碎试验，以期对研究有所帮助。

　　1材料和方法1.1材料收入少，可采取二次分配和风险基金的办法3.2分析生产弹性、合理调控蚕茧的生产供应量。不管是米取价格鼓动、宣传鼓动还是行政推动都要适度，避免出现一哄而上搞蚕茧大战，到最后两败俱伤。

　　蚕业生产由传统生产型向产业化生产转变是茧丝绸行业发展的必然趋势，也是推进产业化进程的标志和目标。我们只有以体制创新为突破，依托/公司+农户“的蚕业化经营模式，增强农民在产业中的主体地位，使农民真正成为生产经营的市场主体和整个产业的受益主体，从而使广大蚕农脱贫致富奔小康，为建设社会主义新农村奠定基础。

　　苏云金芽孢杆菌为四川省蚕丝学校微生物实验室保存。

　　7532，做菌种复壮用。

　　超声波破碎机由宁波新芝生物科技股份有限公司生产。

　　电热恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、平皿、克氏瓶、吸管、试管等。

　　牛肉膏蛋白胨液体培养基和固体培养基（营养琼脂）。

　　将冷冻菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基培养18~20h，给2、3龄起蚕添食，待蚕儿发病死亡后，进行细菌分离和鉴定，确认为家蚕猝倒病病原一苏云金芽孢杆菌猝倒亚种。

　　试验用液的制备：复壮种一定量接种于营养琼脂克氏瓶中，恒温37*C分别培养14h和24h，用适量生理盐水洗下菌苔，配制成试验所需浓度，4*C冰箱保存。

　　1培养14h细胞液的破碎取培养14h的试验用菌液200ml选择56，510的变幅杆，应用工作5s休息5s的运行模式，对不同浓度的菌液实际破碎10、20、30、40、50min后，进行活菌计数。

　　24小时的试验用菌液的200ml选择56，510的变幅杆，运用工作5s休息5s的运行模式，对不同浓度的菌液实际破碎10、20、30、40、50、60min后，进行活菌计数。

　　参照《微生物实验手册》中介绍的方法进行活菌计数，无论是培养14h还是24h的菌液都是在6h内结束超声波破碎试验，不考虑细菌的自然死亡。

　　2.1培养14h的苏云金芽孢杆菌菌液破碎结果表1培养14h菌液的破碎结果变幅杆5菌液浓度工作时间平均活菌率平均破碎率（％）*随着工作时间的增加，肉眼观察可见菌液浊度降低而透明度增加。

　　不同的细菌浓度，用同样的变幅杆（56或510），在相同的工作时间内，50亿/ml的破碎率比100亿/ml的高1.75~8个百分点；相同的细菌浓度（50亿/ml或100亿/ml），用不同的变幅杆（56和510）达到相同的破碎率时间基本在10min左右，但无论用56或510的变幅杆，还是50亿/ml或100亿/ml的细菌浓度，达到95%以上破碎率所需用时间在50min内。

　　2.2培养24h的苏云金芽孢杆菌菌液破碎结果度，也无论用56或510的变幅杆，在30~60min的工作时间内，菌液的破碎率在6. 5~12%之间，如考虑到培养24h苏云金芽孢杆菌菌液内的少部分（约10%左右）营养细胞和计算误差外，完全可以认为超声波对培养24h苏云金芽孢杆菌芽孢的破碎无明显效果。

　　表2培养24h菌液的破碎结果变幅杆5菌液浓度工作时间平均活菌率平均破碎率（％）*随着工作时间的增加，肉眼观察可见菌液浊度无明显变化。

　　随着生物工程技术的发展，苏云金芽孢杆菌的应用正变得越来越广，而找到其有效的破碎方法，具有非常重要的理论和实践意义。在实验和研究工作中我们常用超声波来破碎细胞以分离细胞成分或用于免疫化学研究。本次试验表明，虽然能否形成芽孢是菌种的遗传特性，但是同时也与环境条件如培养时间、营养条件等有关系。对于培养14h还没有产生芽孢的苏云金芽孢杆菌菌液来说，超声波破碎法在试验条件下，无论选用*6变幅杆还是直径相对较大的510变幅杆，也无论菌体浓度是50亿/ml，还是100亿/ml，达到95%以上的破碎率所需时间为30~ 50min，破碎效果较为理想；然而对于培养24h已经产生芽孢的苏云金芽孢杆菌菌液来讲，菌液中既有芽孢，还有部分营养细胞，从表2可以看出，破碎率均较低，超声波破碎法的效果是极不显著的。

　　超声波是振动频率超过2万Hz的声波。

　　它能通过强烈的振动使细胞破裂，细胞内含物外泄而死亡。超声波的破碎效果与处理功率、频率、次数、时间、微生物类型及其生理状态等因素有关。芽孢的抗逆性强，几乎不受超声波处理的影响，故芽孢的破碎宜用其它方法。本次实验表明：应用超声波处理苏云金芽孢杆菌应特别注意该菌培养时间、培养条件和生物状态。

　　本次实验采用非灭活细胞破碎，对环境的要求较为严格，但通过细菌计数，可以比较明确地掌握各个时间段的细胞（包括休眠细胞-芽孢）破碎情况，至于灭活的苏云金芽孢杆菌菌体及其芽孢最佳的破碎方法和破碎情况，尚有待进一步研究。